项锡勇　黄浩　宋方茗

摘要：本文选用小鼠LPS骨溶解模型探索骨外科手术模拟操作的可行性。实验证明LPS骨溶解模型能够较真实地模拟人类骨关节炎情况，可利用头颅注射法，达到LPS骨溶解模型的建立，采用双蒸水制备LPS溶液，最后在HE及TRAP染色的条件下，利用仪器来进行骨溶解的观察及计算破骨细胞计数及TRAP数量和骨陷窝变化。采用小鼠LPS骨溶解模型进行骨关节炎模拟的临床前教学，可以提高学生对骨关节炎发生机制和治疗体系的理解，强化学习效果，值得在医学本科生教学和各层次骨学继续教育学习班操作课程中进一步推广。

关键词：LPS；局部骨溶解模型；破骨细胞；TRAP；骨陷窝；临床前教学

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）44-0214-02

一、前言

随着时代的发展，人们的生活水平不断改善和提高，生活方式也随之改变，但骨关节病的患病率却在逐年增加，因而对于骨关节病的治疗人们也开发了许多方法，其中人工关节置换术是最能有效治疗晚期骨关节病和恢复关节功能的一种有效方法，也是目前临床上治疗晚期骨关节病的重要方法。但该种方法也存在着许多问题从而导致手术的失败，例如无菌性松动和假体周围骨溶解这两种因素。有研究发现在UHMWPE导致的骨溶解的鼠模型中有内毒素的积聚现象，其主要成分是LPS，因此骨溶解及骨吸收等可能与LPS密切相关。炎症性骨疾病中骨生长重建规律尚不明确，而通过研究LPS介导下炎症性骨疾病中破骨细胞的分化和活性调控机制，对于明确其规律起重大作用，同时也能为感染性骨疾病的治疗提供新方向。

人工关节置换从设计—应用—改进—再应用经历了近百年的发展，已经成为治疗关节疾病的标准手术之一。在发达国家，人工关节置换术已经成为对严重的髋、膝关节病变施行外科重建的常规手术方法，它的目的是解决关节的疼痛问题、改善关节使其运动功能得到恢复以及矫正关节畸形。虽然人工关节置换术后关节活动较好，可早期下地活动，能减少老年患者长期卧床等，但术后仍可发生假体磨损、假体无菌性松动、假体周围骨折骨关节置换等状况，假体磨损或假体颗粒或假体有细菌残留，容易导致炎症，从而导致骨破坏，最终手术失败，让患者再次经历二次手术。[1]骨髓炎、内置物手术后感染易引起持久性炎症反应，不仅损害病人身心健康，而且给病人经济带来负担。据统计假体术后感染并发症的医疗支出人均约50000美元，全美每年达2500亿美元。[2]人工关节的无菌性松动是影响关节置换术后远期疗效的主要因素。在无菌性松动的假体周围可以看见骨质有明显的溶解现象，使其支撑结构破坏，致使假体松动。[3]近年来，越来越多的临床实践表明，脂多糖可黏附多种人工假体材料并刺激细胞产生多种溶骨性因子，从而促进骨溶解。为了适应时代发展趋势，为骨关节手术教学提供更多、更具有实用性的教学研究平台，我们对通过建立C57小鼠局部骨溶解模型模拟LPS诱导骨溶解进行了尝试和评价。

二、教学方法

1.LPS溶液制备：实验采用双蒸水配制成浓度为2g/L的LPS溶液，过滤除菌，-20℃保存；临用前用双蒸水溶液分别稀释1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L。

2.体内骨溶解模型的制作：取生理状态基本相同的C57小鼠30只，其中5只作为空白对照，其余25只随机分为五组实验组1、2、3、4、5，分别定期（共计四次，隔天注射，即第一天、第三天、第五天、第七天）颅盖骨骨膜注射浓度为1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L的LPS溶液100μL。术后即第八天颈椎脱臼处死小鼠，取出完整颅盖骨进行常规组织石蜡。

3.切片、HE及TRAP染色，显微镜下观察软骨组织学特征。[4]

4.骨溶解的观察及计算：组织蜡块用德国LeicaRM2135切片机切片，连续三层切片，层厚3.5μm。行常规HE染色，10×、20×及40×条件下观察，40×条件下摄像。图像用Maticimages2.0软件处理，计算正中矢状线区域骨吸收溶解面积，结果用均数±标准差表示。[5]

5.破骨細胞计数及TRAP数量和骨陷窝变化：抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）是破骨细胞的特异性染色[6]。组织蜡块用德国LeicaRM2135切片机切片，连续三层切片，层厚3.5μm。按说明书操作，将切片浸泡，避光37℃温箱温育90分，着色完全后移去反应液，脱水干燥后明胶封。Olympus电子显微镜20×、40×及100×条件下观察，10×条件下摄像计算正中矢状线区域的TRAP+细胞数量，结果用均数±标准差表示。观察每个细胞中骨陷窝大小、数量、深度。

三、预期结果

1.实验组与对照组相比，对照组中的基本没有骨溶解现象，实验组在图像中可明显观察到骨溶解的面积。而在电子显微镜观察下的切片中可清晰地看到实验组的破骨细胞、TRAP数量明显多于对照组，并且骨陷窝深度更深、面积更大、数目更多。

2.在五组实验组中，随着LPS溶液浓度的增大，骨溶解现象更加明显，具体表现在骨溶解面积变大，破骨细胞、TRAP数量增多，以及骨陷窝深度更深、面积更大、数目更多。

四、讨论

对全科医师骨关节炎治疗技术继续教育课程或是医学本科生教学来说，怎样让学员获得更多有关基础骨外科手术操作的亲身真实体会，将得到的实践感知与理论知识结合，保正将所学的医学技术适当、精确地运用到临床手术中，最后为患者带来真正有效的治疗，一直都是医学教育工作者探讨的热点问题。所以在医学本科生教学或骨科学继续教育学习班课程中，对学生进行有效的骨溶解模型临床前培训就显得十分重要。

根据以往所采用的教学方式而言，例如动画模拟、临床实践见习和塑料橡胶模型等方式，就其结果所反映效益来说，以动物模型标本为对象的骨关节手术临床前模拟操作方式最能让学生学到有用知识，最大限度符合教学预期效果。值得一提的是，此类教学方式与许多专家学者所主张的“在没有真实病人的情况下为学员提供一个真实模拟环境以及反复练习新技术的机会”思想不谋而合。而在我们的实验中，所采用小鼠局部骨溶解模型方法就能够较真实地模拟人类骨关节组织情况，犹如在真人骨关节中一样，便于学生与老师实施各类基础骨关节手术操作练习及展示，不仅实践感觉真实和视野清楚，更能给骨外科病学继续教育学习班课程学习或医学本科生教学提供了良好的基础骨关节手术临床前教学平台，值得全方位地推广和使用。

参考文献：

[1]段钢，朱自强.脂多糖对人工关节磨屑诱导的骨溶解的影响[J].徐州医学院学报，2008，28（4）：242-244.

[2]范卫民，王青，陶松年，等.肿瘤坏死因子与人工关节无菌性松动关系的探讨[J].南京医科大学学报，2000，20（2）：117-118.

[3]周景辉，吴耀持，李石胜，朱伟民，张圣宏.鼠类膝骨关节炎模型的评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（33）：6206-6209.

[4]王婧，张忠辉.大鼠关节炎三种动物模型的建立和比较[J].中国细胞生物学学报，2010，32（3）：456-460.

[5]张亮，陈志荣.一种磨损颗粒诱导的骨溶解模型的制作[A].宁夏医学杂志，2008，30（4）：298-299.

[6]朱彤，刘勇章，胡小鵬.家兔膝关节骨关节炎动物模型的建立[J].医学临床研究，2006，23（8）：1188-1190.

Abstract：The feasibility of using LPS osteolysis model to explore the operation of bone surgery was studied. Experiment proved that LPS bone dissolve model can simulate a real human osteoarthritis，head shots，available to dissolve the LPS bone model，adopt double LPS solution，and finally in the steaming water preparation HE stain and TRAP conditions，using the instrument for bone dissolve observation and calculation，broken bone cell count and number of the TRAP and the bone pit changes. The osteoarthritis LPS in mice bone dissolve model simulation of preclinical teaching，and can improve students' understanding of osteoarthritis occurred mechanism and treatment system，strengthen the study effect，is worth in the medical undergraduate teaching and at all levels continue to education to accelerate the operation course of further promotion

Key words：LPS；partial osteolysis model；osteoclasts；the TRAP；the bone pit；preclinical teaching