丁利 张嘉 惠文利

[摘 要] 生物化学实验是“生物化学”教学中的重要组成部分，生化实验内容的选取既要与基础理论课内容相协调，也要不断发展，将新的科研成果融入其中。目前生化实验教学内容大多涵盖了蛋白质、核酸、维生素等部分内容，但是对于糖类知识模块较少涉及。糖类不仅是组成生命的三大类物质之一，对其生物活性的研究更是当前生命科学热点前沿之一。因此，借着当前教学革新的契机，有必要合理地选取一些成熟的糖生物学研究成果，将其运用到生化实验教学中去。通过探讨将唾液中抗流感相关糖链的检测应用到实验教学中去的可行性，使教学内容与生活实践相结合，不仅能够增强学生对糖链生物学功能的认识，更能使他们接触到科学前沿，增强对科学研究的兴趣。

[关键词] 生物化学;糖生物学;实验教学;教学革新

[基金项目] 2019年度西北大学教学成果奖培育项目“生物化学实验教学提升研究及推广”（XM05190475）

[作者简介] 丁 利（1980—），女，河南洛阳人，博士，西北大学生命科学学院讲师，主要从事糖生物学研究;张 嘉（1966—），女，四川乐山人，学士，西北大学生命科学学院高级工程师，主要从事食品与制药工程研究;惠文利（1976—），女，陕西三原人，博士，西北大学生命科学学院副教授（通信作者），主要从事纳米生物医学研究。

[中圖分类号] G642.4   [文献标识码] A    [文章编号] 1674-9324（2021）07-0005-04   [收稿日期] 2020-12-13

“生物化学”是面向生物学相关专业学生开设的一门重要基础课程，也是高校本科生进入大二以后接触到的第一门专业课。由于生物化学是一门实践性很强的学科，理论课中讲到的专业知识大多来源于一线的科学研究，因此与之配套的实验课成为生化教学中的重要组成部分。“生物化学”理论课上介绍了参与生命活动的各种生物大分子，主要包括糖类、氨基酸及蛋白质、核酸这三大类物质，然而目前的实验教学主要侧重蛋白及核酸相关内容，糖类相关教学内容相对比较缺乏。尤其当前在科学前沿关于糖链的研究正蓬勃展开，人们已经认识到糖类除了作为能量物质外，还具有非常重要的生物学功能，糖链的研究已被公认为是继蛋白质和核酸的研究后探索生命奥秘的第三个里程碑。因此本文主要探讨如何将当前糖生物学研究的前沿成果有机地融入本科生化实验教学中来。

一、设置糖生物学内容的重要性

20世纪60年代左右，科学家们发现生物体内的信息流从DNA到最终翻译为蛋白质后并没有终止，而是存在着从蛋白质到糖类的延续，糖基化对于蛋白质及整体生物学高级功能的体现至关重要。糖链是继蛋白质、核酸之后，被人们发现的参与生物机体重要生命活动的三类生物大分子之一[1]。糖链因具有不同的糖苷键、立体构型及分支结构，从而含有比蛋白质及核酸结构更为丰富的生物学信息。

糖类最早仅作为生物体的能量和结构物质而被人们所熟知，由于其结构的复杂多样性，以及分析方法的相对局限，阻碍了对其生物学作用的进一步认识。近些年来，随着细胞生物学及分子生物学的快速发展，以及现代分离、分析技术的进步，糖类更为重要的生物学功能不断被发掘。研究发现，哺乳动物细胞表面70%的蛋白均具有糖基化修饰，这些糖链可以通过与受体蛋白之间的相互作用介导细胞的专一性识别作用，进而参与生命的调控过程。近年来的研究结果已证实，糖链几乎参与了真核生物所有的生理和病理过程，无论在正常的精卵识别、生长发育及生命稳态的维持，还是在病原体感染、炎症、自身免疫调节、癌细胞增殖转移等过程中均发挥着重要作用[2]。

由于糖生物学研究的巨大意义，世界各科技强国都对其给予了高度重视，投入了大量人力财力，例如美国在佐治亚大学、加州大学圣地亚哥分校分别建立了糖复合物研究中心、糖生物学研究及培训中心，并于2001年资助成立了美国国立卫生研究院下属的功能糖组学联盟，英国1992年在牛津大学成立了糖生物学研究所，欧盟制定了“欧洲糖类研究开发网络计划”等，日本政府1991年开始投资数百亿日元实施计划15年完成的“糖工程前沿计划”……我国则分别于1994年、2007年、2011年在复旦大学、山东大学、江南大学成立了卫生部糖复合物重点实验室、国家糖生物技术研究中心及教育部糖化学与生物技术重点实验室，并通过“863计划”“973计划”和重大科技专项等项目不断加大对糖生物学研究的支持力度[3]。关于糖链的研究已成为当前生物学领域新的热点之一，进而促进和形成了一门新兴交叉学科——糖生物学。目前糖生物学理论课程已经在北京大学、清华大学、复旦大学、厦门大学、山东大学、江南大学、西北大学等诸多高校本科生课程中开设，然而相关的实验教学内容则很少见到。21世纪生命科学亟待解决的问题是对生物体高层次生命现象的解释，因此，围绕糖类这一重要的参与细胞识别、调控的信息分子的研究是必不可少的，也会成为大多数生物学专业学生在未来科研课题中要接触或涉及的内容，所以非常有必要在本科阶段进行糖生物学相关实验技能的培训[4]。此外，目前糖生物学已向生物医学领域的其他学科广泛渗透和融合，形成了糖免疫学、糖病理学、糖神经生物学等学科分支，这些相关学科及研究方向也需要学生具备一定的糖生物学实验基础[5，6]。

二、糖生物学实验教学内容的选取——以人类唾液中抗禽流感相关糖链的检测为例

在各国科学家的重视下，糖链的生物学功能及其在疾病发生发展过程中的作用机理开始不断被认识和揭示，其中尤其是对于糖链在流感病毒入侵宿主过程中的机制研究最为深入和成熟。

科学家们发现流感病毒表面的血凝素可以通过与宿主细胞表面的糖链受体进行识别结合，进而开启侵染宿主的过程[7]。不同的流感病毒识别结合的糖链受体结构有所差异，人流感病毒主要识别结合α2，6连接的唾液酸糖链结构，这种唾液酸受体主要分布在人上呼吸道中;禽流感病毒主要识别α2，3连接的唾液酸结构，其主要分布在人下呼吸道和支气管中。目前大多数抗流感药物的设计如达菲等均是这种唾液酸结构的类似物，通过竞争性地与流感病毒结合，进而减少其与宿主细胞表面唾液酸糖链受体的结合。

在正常的生理状态下，唾液作为人体免疫的第一道防线，可以通过分泌相关的含有唾液酸糖链的糖蛋白来中和或封闭流感病毒对机体细胞的结合与侵染，如黏蛋白、分泌型IgA（SIgA）等，这些蛋白上唾液酸糖链的表达水平与其中和流感病毒的能力密切相关。西北大学糖生物学团队李铮教授在该领域的研究取得了较大进展，该课题组详细地研究了健康儿童、成人和老年人唾液中糖蛋白的表达差异，发现老年人唾液中α2-3唾液酸糖链表达水平较高，能更有效地与H9N2等禽流感病毒结合，因而具有较强的禽流感病毒抵御能力。但具有糖尿病、慢性病等老年人唾液中α2-3唾液酸糖链水平显著低于正常对照组，是禽流感病毒较易感人群[8，9]。此外，国外相关研究也同样指出可以通过唾液中相关唾液酸糖链结构表达水平来判断个体感染禽流感的风险[ 10 ]。

由于唾液中具有可以封闭流感病毒表面受体的唾液酸糖链结构，其含量多少能够影响不同个体对于流感病毒的抵抗能力，因此可以用来判断不同人群对于流感病毒的易感性。唾液中的唾液酸糖链阻止流感病毒侵染宿主细胞的机理相对比较清楚，检测方法相对比较简单，并且与学生的日常生活密切相关，学生具有较高的兴趣和接受度，因此将这一内容融入实验教学的条件较为成熟和可行。

三、教学内容的可行性分析

目前对于唾液酸糖链结构的检測可以通过相对较为专一的凝集素进行。凝集素（Lectin）是一类能够与糖蛋白糖链结构发生特异性结合的非酶蛋白，具有高度保守的糖识别域，能够专一性地识别不同的糖链结构，在实验中可以作为特定的糖链检测工具。由于马鞍树凝集素-II（Maackia Amurensis Lectin II，MAL-II）识别结合的α2-3唾液酸糖链结构与禽流感病毒血凝素相似，因此常用来模拟预测宿主感染禽流感的情况。在本实验中可以通过直接购买Cy5荧光标记的MAL-II对唾液中的α2-3唾液酸糖链进行专一性检测。

本实验可以安排在聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）实验之后，也可在SDS-PAGE实验中直接利用学生自己的唾液样本进行凝胶电泳;然后将电泳后的凝胶进行PVDF转膜实验，从而保证整个实验过程在3～4学时内完成。

实验所需器材有：唾液收集器、离心机、半干转膜仪、聚丙烯酰胺凝胶（可直接购买预制胶）、PVDF醋酸纤维素薄膜、转膜缓冲液、Carbon-free无糖封闭液、荧光染料Cy5标记的MAL-II凝集素（Cy5-MAL-II）、垂直电泳仪、荧光扫描仪。实验所用到的均为常规仪器，预制胶、Carbon-free封闭液及Cy5-MAL-II用量不大，均可从生物公司直接购买，转膜缓冲液中所用到的甲醇可以用乙醇取代，安全无害且不影响实验结果。

四、教学内容的设计及操作过程

本教学实验主要可分为以下几个步骤：

1.采样（约20min）：实验开始前，每位同学先用生理盐水漱口以去除口腔中的食物残渣，然后低头静坐，用唾液收集器收集自然分泌的唾液约1mL，采集时间约为5min。然后将采集到的唾液转入2mL无菌离心管中低温12000rpm离心10min，取上清后用滤膜过滤掉唾液中小分子水及无机盐类，将蛋白浓缩至200μL，备用。本实验所用的唾液样本来自学生本人，采集过程安全无创，能够极大地提高学生的兴趣及参与度，该步骤操作也较为简单，对本科生无难度。

2.SDS-PAGE（约60min）：吸取处理后的蛋白样品20μL，加入5×上样缓冲液5μL，沸水浴中加热5min，然后用上样移液枪将其加入预制胶胶孔中，120V/40mA进行电泳，约45min后溴酚蓝到达预制胶下沿时停止。胎球蛋白中含有α2-3唾液酸糖链，可以作为参照物，同体积上样20μL（500g/ml），随样本同步进行操作。每位同学均可使用自己所采集处理好的唾液样本进行该步骤操作。

3.转膜及孵育（约100min）：裁剪好的醋酸纤维素薄膜浸泡于转膜缓冲液中（面积7×6cm大小，实验前老师准备好），用半干转膜仪，将电泳后的凝胶转移到醋酸纤维素薄膜上，在400mA恒流条件下转膜50min，用Carbon-free封闭液封闭10min，然后在其中加入Cy5荧光标记的MAL-II（终浓度1mM）孵育40min，将膜取出放入TBST缓冲液中等待扫描。该部分内容类似于Western blot，是生物学专业经常用到的实验技能。

4.结果扫描及数据读取（约20min）：将PVDF膜放入荧光扫描仪中635nm处进行扫描，并获取每个条带的荧光信号值。

本实验共计用时200min，可以保证在四个学时内完成，可作为一次实验课进行，也可以分两次进行，在第二步SDS-PAGE电泳结束后可以先将凝胶放入转膜缓冲液中存放，后续步骤可以继续在第二次实验课完成。

五、讨论

生化实验课不仅要有助于学生对于专业理论知识的理解，更要着重培养学生的科研素养及探索精神，近年来高校不断鼓励教学科研人员将一线研究成果融入教学实践中来，以使教学内容紧扣科研前沿，与生产生活相联系，激发学生的学习兴趣。

蛋白质、核酸和糖类是构成生命的三类大分子，随着蛋白质和核酸中的奥秘被知晓，糖类的重要性也浮出水面，成为生命科学研究中的新热点。目前关于糖类的研究前沿已经从基本的结构和能量物质转移到生物学活性方面，各院校关于糖生物学的理论课教学正在逐步开展。然而笔者翻阅大部分院校的生化实验教学大纲后发现，目前关于糖生物学知识模块的实验教学内容开展得非常少，生化实验指导用书中涉及的糖类实验内容大多是针对传统的浓度测定，例如蒽酮比色定糖法、总糖及还原糖的测定等，而针对糖链生物学功能的教学设计基本没有见到。

流感病毒是大家在日常生活中较为熟悉的一种致病微生物，围绕其致病机理的研究能够引起学生对该实验的极大兴趣。本实验的设计将糖生物学的内容融入其中，能够启发学生对于糖链生物活性的认知，激发他们在该领域的求知欲，引导他们接触到更多的糖生物学一线研究。在教学内容衔接上，该部分能够与目前常规开设的SDS-PAGE实验融为一体，使学生在掌握实验基本技能之外，能够进一步增强对于课堂理论课的理解，提升科研素质。

六、结语

糖生物学作为一门新兴交叉学科，涉及生物化学、微生物、分子免疫学等方面的知识，对其实验教学内容的选取既要结合这些方面的主要研究技术，又要围绕当前糖生物学研究的主要内容。本文主要以人类唾液中抗禽流感相关糖链的检测为例进行了教学内容设计及可行性分析，本实验中所用到的方法能够与常规的生物實验技术相融合，实验内容上也选取了相对简单及成熟的糖生物研究案例，并计划将其进一步应用到实际的教学实验中去。相信随着糖生物学研究成果的不断成熟，会有越来越多的实验内容可供选择，使同学们能够在本科阶段更加充分地接触到糖生物学这一研究前沿。

参考文献

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On the Introduction of the Related Glycobiology Content into the Experiment Teaching of Biochemistry

DING Li， ZHANG Jia， HUI Wen-li

（Biochemistry Teaching and Research Group， College of Life Sciences， Northwest University，

Xian， Shaanxi 710069， China）

Abstract：The teaching of biochemistry experiment is an important part for the course of Biochemistry. The teaching contents of biochemistry experiment should be coordinated with the basic theory courses and integrated with the new scientific research results. At present， the teaching contents of biochemistry experiments mainly cover protein， nucleic acid， vitamin and so on， but the knowledge about carbohydrate is rarely included. As one of the most important three constituents of life， the research about carbohydrate， especially its bioactivity— glycobiology has been a hot frontier of life science. In the current teaching innovation， it is necessary to select some mature research results of glycobiology and apply them into the biochemistry experiment teaching. In this paper， we take the saliva anti-influenza virus glycan detection as an example， analyze its application feasibility in biochemistry experiment teaching， so that the teaching content can be combined with life practice. This kind of teaching content will improve the glycobiology knowledge of student， expose them to the forefront of life science， and increase their interest in scientific research.

Key words： Biochemistry; glycobiology; experiment teaching; teaching innovation